PROTAC技术研究研究进展

一、  PROTAC (Proteolysis Targeting Chimeras)生物学背景

PROTAC（蛋白降解靶向嵌合体）是一种具有双功能的杂合小分子，通过合适的连接链将靶蛋白配体与E3泛素连接酶配体连接，促使目的蛋白（POI）与E3连接酶形成三元复合物，从而使靶蛋白接近泛素化系统，实现靶蛋白的泛素化，随后被蛋白酶体的26S亚基识别，最终导致靶蛋白降解。[2]

具体过程如下：PROTAC两端的配体分别识别E3泛素连接酶和目标蛋白，形成靶蛋白-PROTAC-E3连接酶的三元复合物，将靶蛋白和E3连接酶拉近，随后将泛素转移到靶蛋白上，蛋白质酶体接受被泛素标记的蛋白质将其切成7~9个氨基酸组成的短肽。

Fig. 1. Direct recruitment of an E3 ligase by using the PROTACs[2]

由于PROTAC 可降解整个蛋白，因此可清除激酶的酶活及非酶活功能。此外，PROTAC降解蛋白具有催化性，在引发靶蛋白泛素化之后，即可复合物中解离，并进入下一催化循环。因此， PROTAC可在非常低的剂量下发挥作用。传统抑制剂发挥作用是位点竞争、位点占据的作用模式，而PROTAC介导的降解是反复迭代的模式，因此在靶蛋白突变或过表达情况下，PROTAC会表现出更好的耐受性。因此，，PROTAC以其颠覆性的设计、颠覆性的作用机制、挑战“不可成药”靶点的想象空间，近年来已成为当前新药开发领域中最大热点。

1999年，蛋白降解剂首次进入专利文献，来自生物技术公司Proteinix的研究人员John Kenten等提交了一项小分子化合物的专利，该化合物可以利用泛素机制降解目的蛋白（protein of interest , POI）。

2001年，Raymond. Deshaies（美国两院院士）和耶鲁大学教授Craig. Crews等人最早提出PROTAC概念，并成功地设计和合成了第一批PROTAC双功能分子用于降解甲硫氨酰氨肽酶2 （MetAP-2）。[1] E3连接酶识别配体是一个十肽，由此奠定了第一代PROTACs的基础——基于多肽片段设计的PROTACs。继MetAP-2后，Crews课题组陆续设计出了靶向降解MetAP2、雄激素受体等的PROTACs分子，将这些分子显微注射进细胞后发现它们可以和靶蛋白特异性结合并将蛋白降解，并且他们发现靶蛋白识别配体不局限于抑制剂，激动剂也可以起到降解靶蛋白的目的。但不尽如人意的是第一代PROTACs分子包含肽段序列，导致分子量相对较高，细胞渗透性差，降解活性较低，停留在微摩尔水平，并且肽段的存在可能引发免疫原性的产生，所以第一代PROTACs并未成功。

Fig. 2. (A) Protac-1 targets MetAP-2 to SCF（Skp1-Cullin-F box complex containing Hrt1 (SCF) is a ubiquitin ligase complex）. Protac-1 is a chimeric molecule that consists of a phosphopeptide moiety and a small molecule moiety that interacts with the protein target. Ub, ubiquitin; H, Hrt1. (B) The synthesis scheme for Protac-1 (see Materials and Methods). [1]

2008年，Crews和Ciulli课题组拓展了E3连接酶的小分子配体，促进了第二代的PROTACs的发展。以聚乙二醇作为linker连接配体Nutlin（E3泛素连接酶MDM2的配体）和蛋白配体SARM（雄激素受体调节剂）得到的SARM-nutlin PROTAC可将雄激素受体(AR)招募到E3泛素连接酶MDM2，诱导AR泛素化进而被蛋白酶体降解。细胞水平实验显示，该PROTAC分子在浓度为10μmol/L时可以有效降解雄激素受体，尽管药物活性不高，但相较于第一代PROTACs，成药性得到了改善。[3]

Fig. 3. SARM-nutlin PROTAC[3]

2012年，Crews及Ciulli组报道了VHL（von Hippel-Lindau）配体也可用于PROTAC的设计。Crews教授等以HIF-α1（Hypoxia Inducible Factor 1a）为基础设计出了一系列羟基脯氨酸衍生物，这些分子可以高亲和力结合E3泛素连接酶的底物识别亚基VHL。共晶结果表明羟基脯氨酸衍生物可以模拟转录因子HIF-1的结合模式占据VHL上的结合位点。优化过的配体分子量减少到了400道尔顿，成药性进一步提升。[4,5]

Fig. 4. Graphical representation showing the key interactions between 15 and VHL.[5]

2015年迎来了小分子PROTACs的爆发期。Crews教授等开发出两种结合VHL的PROTACs（ERRα和RIPK2），可以在纳摩尔级别将目标蛋白表达量抑制在90%以下（in vitro）。此外PROTACs呈现出良好的组织分布，在异种移植瘤上能很好的靶向目标蛋白。数据显示PROTACs的knockdown效果优于RNAi and CRISPR。[6]

Fig. 5. Proteolysis targeting chimeras (PROTACs). [6]

(a) Proposed model of PROTAC-induced degradation. Von Hippel–Lindau protein (VHL, gray) is an E3 ubiquitin ligase that, under normoxic conditions, functions with a cullin RING ligase (green and yellow) to degrade HIF1α. PROTACs recruit VHL to target proteins to induce their ubiquitination and subsequent proteasome-mediated downregulation. PROTACs were generated to two target proteins: the orphan nuclear receptor ERRα and the protein kinase RIPK2. (b) Structure of PROTAC_ERRα. The parent ERRα ligand is shown in orange and the modular VHL ligand in blue, with asterisks indicating stereocenter(s) whose inversion (in PROTAC_ERRα_epi) abolishes VHL binding. (c) Structure of PROTAC_RIPK2. The parent RIPK2 ligand is shown in green and the modular VHL ligand in blue, as in b.

     CRBN是E3泛素连接酶复合物CUL4-RBX1-DDB1-CRBN的一个底物识别构件，CUL4-RBX1-DDB1-CRBN可以催化泛素分子结合到特异的底物蛋白上，由此标记出要进行降解的蛋白质。大约60年前，沙利度胺（thalidomide）被开发出来作为一种镇静剂在40多个国家广泛销售，用来提供给孕妇治疗孕吐。然而不久之后它便被发现可导致服药孕妇的孩子严重的出生缺陷，如肢体畸形而遭到禁用。

Fig. 6. 沙利度胺、来那度胺、泊马度胺的化学结构

近期研究发现CRBN是沙利度胺及其衍生物泊马度安、来那度胺等药物免疫调节剂的作用靶点。沙利度胺、来那度胺、泊马度胺的化学结构极其相似，与CRBN结合的Ki值分别为249.2 nM、177.8 nM、156.6 nM。机制研究表明，这些药物免疫调节剂结合CRBN后促进新底物的招募，例如Ikaros, Aiolos 和casein kinase 1A1 (CK1a)，从而引发新底物泛素化及随后降解。因此，CRBN逐步成为PROTAC技术中应用最广泛的一种E3泛素连接酶。

2015年，诺华的研发负责人James Bradner在《Science》上发表新一代基于沙利度胺类似物的PROTAC分子，从而引爆了整个领域。用邻苯二甲酰亚胺（沙利多胺的一个化学衍生物）构建了一个适配器，并将其附加在BRD4抑制剂JQ1上用于招募cereblon（CRBN），JQ1和邻苯二甲酰亚胺“偶联物”（称为dBET1，PROTACs）处理白血病细胞时，细胞内的BRD4蛋白在不到一个小时内就被分解。这种快速而广泛的降解表明，偶联物能够防止或阻碍癌细胞对靶向疗法产生耐药性。dBET1的选择性极好，在整个细胞7000多个蛋白质中只有三个蛋白被降解：BRD2、3和4。这项技术——他们称之为“degronimids”。[7]

Fig. 7. Design and characterization of dBET1. (A) Chemical structure of JQ1 (S), phthalimides, and dBET1. (B) Vehicle-normalized BRD4 displacement by AlphaScreen (triplicate means T SD).[7]

Fig. 8. Time table describing the evolution of PROTACs (2001–2016): above time arrow (left): first time different protein or protein families were targeted using the PROTAC technology. Box: Example of targets that have been explored with the PROTAC technology. Below time arrow (right): important milestones for the PROTAC technology development.[8]

PROTACs最大的优势之一是能够使靶点从“无成药性”（undruggable）变成“有成药性”，这使其成为控制特定细胞蛋白水平的强大工具。但是，PROTAC的催化特性可能导致不受控制的降解，引起全身毒性问题，从而限制了PROTAC在临床中的应用。近日，在Science Advances上的两篇背靠背文章实现了光控的精准时空激活的PROTAC，由E3连接酶配体、光开关和目标蛋白质配体三个功能分子组成。

纽约大学的研究团队通过靶向BET家族蛋白（BRD2,3,4）或FKBP12的PHOTACs (PHOtochemically TArgeting Chimeras)，证明了新分子的有效性。特定波长光照下，分子在非活性状态（黄色五角）和活性状态（红色五星）间转变，具备时空精度。[9]

Fig. 9. PROTACs and PHOTACs.

Fig. 10. 光照时分子在trans isomer (left) 和 cis isomer (right)间相互转变。

哈佛医学院和西奈山医学院研究团队以度胺类抗肿瘤免疫调节药物pomalidomide上添加光不稳定的caging group基团设计opto-PROTAC。光诱导opto-pomalidomide基团打开（uncaging），介导IKZF1/3降解。在另一个实验中，光通过控制opto-dBET1介导BRD降解；同时，光通过控制opto-dALK介导ALK融合蛋白降解。[10]

Fig. 11. 365 nm UVA可以解笼Opto-pomalidomide

二、                      PROTAC在研企业或高校

1)                      Arvinas（公司官网. https://www.arvinas.com/）

在以上科学进展基础上，近年来研究人员设计合成了多种PROTAC分子并实现不同类型靶蛋白的降解，用于各种疾病治疗，包括癌症、病毒感染、免疫紊乱以及神经退行性疾病等。现阶段PROTAC在各个治疗领域正以迅猛势头发展壮大，为了将基于PROTACs技术的蛋白降解剂推向临床，耶鲁大学Craig Crews教授在2013年成立了全球首家以PROTAC技术进行药物研发的公司Arvinas（80余人）。

ARV-110是Arvinas在蛋白降解靶向嵌合体领域的全球首个进入临床试验的口服生物可利用的PRAOTC小分子药物，选择性靶向降解雄性激素受体（AR）。2019年5月29日FDA批准开展一项阶段性、开放标签、剂量递增的临床I期试验，用于评估在先前至少接受过两种全身性疗法中转移性去势抵抗性前列腺癌患者中ARV-110的安全性、耐受性、药代动力学和药效学。该试验预计入组患者36人，年龄 18周岁以上且至少接受过2种已批准的CRPC全身疗法（至少一种必须是阿比特龙或恩杂鲁胺）。进行性mCRPC患者必须接受促性腺激素释放激素类似物或抑制剂进行的ADT（前列腺癌雄激素剥夺治疗）或睾丸切除术。区别于传统的抑制剂，ARV-110无需通过“占据”受体来抑制其功能。另外，该PROTAC药物还可以反复工作，降解新转录的靶蛋白，因此可以克服靶蛋白表达的增加和靶蛋白中的突变。具体的分子结构目前暂时还未公布。

目前最新临床试验数据表明ARV-110具有可接受的安全性。最大耐受剂量（MTD）尚未建立以及2期推荐剂量（RP2D）的确定仍在继续试验中。此外，对于接受过恩杂鲁胺/阿比特龙治疗的患者，ARV-110已显示出抗肿瘤活性，其中2例患者的PSA应答已得到证实，其中1例与肿瘤的减少有关。

ARV-110的部分in vivo数据（VCaP xenograft mouse model和patient-derived xenograft (PDX) model）：

Arvinas融资及研发合作:

2013年至2018年4月，Arvinas完成总计达1亿多美元的融资，获得众多医药投资方的支持。2018年09月29日，Arvinas在纳斯达克上市，共募集资金1.2亿美元。此外，默克4.3亿，基因泰克6.5亿，辉瑞8.3以及拜耳1.1亿美元—四大巨头也巨款助力Arvinas，合作开发蛋白降解疗法。对于其他PROTAC初创企业（KymeraTherapeutics Kymera，C4 Therapeutics，Vividion，Nurix等），国内的红杉资本、民和资本、弘晖资本、通和毓承也有参投。

Arvinas的发展历程：

July 2001 The first major publication describing the PROTAC® technology is published by Arvinas founder, Craig Crews, and team.

July 2013 Arvinas is founded, leading the way in turning targeted protein degraders into treatments for patients.

October 2015 Arvinas announces partnership with Genentech (later expanded in 2017).

Late 2016 Arvinas first creates orally bioavailable PROTAC protein degraders.

January 2018 Arvinas announces partnership with Pfizer.

Early 2018 Arvinas first creates PROTAC protein degraders that cross the blood-brain barrier.

September 2018 Arvinas prices initial public offering of stock (Nasdaq:ARVN).

March 2019 Arvinas begins first ever clinical study of a targeted protein degrader: ARV-110 for the potential treatment of men with metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC).

June 2019 Arvinas announces a partnership with Bayer, including a pharmaceutical collaboration and the launch of an agricultural joint venture, Oerth Bio.

August 2019 Arvinas announces that its second targeted protein degrader has entered the clinic: ARV-471 for the potential treatment of patients with locally advanced or metastatic ER positive / HER2 negative breast cancer.

October 2019 Arvinas announces initial safety and pharmacokinetic data for its first clinical programs, ARV-110 and ARV-471.

Arvinas的研发管线：

2)                      其他外企（化学结构大多未公布）

3)                      国内企业（或高校）

国内布局PROTAC的第一梯队公司主要有凌科药业、分迪科技、苏州开拓药业及五元生物。2018年11月15日，凌科药业(杭州)在第七届中国创新创业大赛生物医药行业总决赛上的泛素蛋白酶靶向降解技术（PROTAC）挑战“不可成药”的蛋白靶点项目荣获一等奖。目前该公司PROTAC研发管线仍处于药物发现阶段，暂未申报。

成都分迪科技主要致力于蛋白降解新药开发领域，创立于2014年，目前，分迪科技已建立了一个专有蛋白降解新药开发平台，开发了独特的PRODED（Protein Degradation Drug）技术。现主要与中山大学附属肿瘤医院合作开发靶向降解Smad3蛋白的PROTAC新药以及利用PRODED平台开发基于蛋白降解机制的抗冠状病毒苗头化合物，结构暂时未公布。此外，暂时未有临床申报的PROTAC药物，正处于早期筛选阶段。

主要讲述了一种“神奇的”小分子——蛋白降解靶向联合体（Proteolysis Targeting Chimera, PROTAC）的诞生过程，它能够在细胞内特异性识别并降解蛋白Smad3，进而阻断肾纤维化以及相关癌细胞的增殖。我们首先使用蛋白-蛋白对接方法确定了Smad3蛋白的配体结合位点，再采用基于对接的虚拟筛选结合人工目筛得到了对Smad3具有潜在亲和力的化合物，并设计得到PROTAC。合作单位采用表面等离子共振技术（Surface Plasmon Resonance, SPR）对我们提供的13个候选化合物进行亲和力验证，其中11个与Smad3有亲和力。根据亲和力最高的化合物8设计的PROTAC分子经细胞实验验证具有降解Smad3的活性。  

Fig. 12. 构建得到的PROTAC分子结构；

Fig. 13. 分迪科技的战略合作不完全汇总

苏州开拓药业股份有限公司由曾任美国Angion药研公司任副总裁的童友之博士于2009年创立。AR-Degrader正在进行临床前研究。

五元生物成立于2015年，目前构建了具有自主知识产权的PROTAC平台，主要应用于新一代抗非小细胞肺癌新药研发，并用类器官技术为 PROTAC分子的提供有效性和安全性评估。

布局PROTAC技术的初创公司还有嘉兴优博、上海睿因、和径医药、海创药业、科伦药业等，但都处于研究的早期阶段。

美迪西建立了以马兴泉博士为首的科研团队建立了PROTAC药物发现技术平台；药明康德与Arvinas和Kymera建立了合作伙伴关系（CRO公司）。

此外，上海宏创医疗科技有限公司、江苏恒瑞医药集团有限公司通过认购美国 Fortunatus Capital 基金份额收购美国Princeps Therapeutics, Inc. 31%股权。Princeps Therapeutics, Inc.是一家总部位于美国马萨诸塞州波士顿的生物技术公司，开发基于的癌症、自身免疫和神经退行性疾病新药。上海宏创医疗科技有限公司出资280万美元，江苏恒瑞医药集团有限公司出资120万美元。

华人学者在相关领域的研究和开发也并不逊色，包括但不限于：密歇根大学王少萌教授、北卡大学熊跃教授、西奈山伊坎医学院金坚教授、清华大学饶燏教授、复旦大学鲁伯埙教授、中国药大姜正羽教授、上科大仓勇教授、杨小宝教授等等。

三、                      PROTAC的优势

1)                      PROTAC可克服肿瘤药物耐药性

针对癌症的小分子药物治疗，除传统化疗外，激酶抑制剂领域在过去的二十多年里取得了蓬勃发展。这些激酶抑制剂已在临床上取得了优异的治疗效果，极大得改善了癌症患者的生活质量并有效得延长了患者的生存期。然而尽管激酶抑制剂十分有效，患者往往还是会在不同的时间内出现对激酶抑制剂的耐药，造成疾病复发。因此肿瘤靶向治疗导致的耐药性是肿瘤研究所面临的一个主要问题，如靶向表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的酪氨酸酶抑制剂吉非替尼，是治疗非小细胞肺癌的一线药物。但在治疗过程中，患者会出现继发性耐药，从而导致治疗效果下降或病情恶化。如BTK共价抑制剂伊鲁替尼，作为治疗套细胞淋巴瘤的药物，在临床使用过程中，BTK会产生C481S缺失突变而形成耐药。除靶点发生突变外，很多耐药原因是靶点出现过表达。因此，PROTAC通过降解整个靶蛋白而在耐药靶点方面表现出更大的优势。

Fig. 14. BTK degrader[11]

2)                      PROTAC可通过降解整个蛋白影响非酶活功能

传统的小分子药物通常通过抑制靶点的酶活功能产生作用，而PROTAC可降解整个蛋白，所以PROTAC既可影响蛋白的酶活功能又可调控非酶活功能。如粘着斑激酶(FAK)是激酶同时也为多种信号蛋白提供支架，在肿瘤入侵、转移的过程中起到至关重要的作用。但临床上通过调节FAK激酶活性抑制FAK功能并不成功。因此,PROTAC提供了一种新的开发思路，即同时封闭FAK的酶活信号及支架功能。Crews课题组于2018年报道了一种高效、选择性FAK降解剂，在FAK的激活并介导的细胞转移和入侵等方面，PROTAC效果优于临床候选药物德伐替尼。因此，这些结果表明PROTAC扩展了现有药物靶点的可成药空间并且可调节传统小分子药物难以调控的蛋白。

3)                      PROTAC有望降解不可成药的靶点

目前已知的蛋白靶点中，只有20-25%用于药物发现，包括激酶、GPCRs、核激素受体、铁离子通道。信号转导与转录激活因子3(STAT3)在细胞生长、繁殖、凋亡、代谢、化学耐药等过程中扮演极其重要的作用。但STAT3结构中没有明显直接的作用口袋，这直接阻断了对STAT3抑制剂的开发，目前尚无有效药物。尽管有研究报道一些具有抗癌活性的STAT3抑制剂，但其作用浓度需要毫摩尔级，且缺乏特异性。王少萌课题组发展的STAT3降解剂在体内体外实验中均有较高活性。[12]此外， RAS蛋白除了缺乏结合口袋，还和其底物GTP间高度亲和（皮摩尔级别），小分子难以和GTP竞争，近年来虽然针对G12C突变KRAS蛋白设计出了靶向药物AMG510，但是G12C突变仅仅是KRAS六种常见突变中的一种，最常见的G12D、G12V突变的KRAS的活性高、选择好的抑制剂的开发依旧是难题，PROTAC有望另辟蹊径，为这些“老大难”的靶点的药物开发提供新的可能。

Fig. 15. Structure-Guided Design of STAT3 SH2 Domain Inhibitors and PROTAC Degraders

4)                      PROTAC提供了一种新型的快速可逆的化学敲除方法

利用PROTAC建立蛋白敲降动物模型可以作为研究靶标基因功能序列丢失的有力补充手段。PROTAC可以作为现有遗传性工具（TALEN或CRISPR-Cas9等基因编辑技术）的一种有效补充手段。[13]

Fig. 16. The schematic illustration of various strategies to inactivate an oncogene or other disease-causing genes at the DNA, RNA or protein level by CRISPR, RNAi or PROTAC, respectively.

四、                      PROTAC面临的挑战

1.                      E3泛素连接酶及其配体的拓展

第二代PROTAC的发展基于新型小分子E3连接酶配体的发现，但发展至今，PROTAC中常使用的E3连接酶及E3连接酶配体屈指可数，最常用的是CRBN和VHL，MDM2和IAP次之，但是人基因组编码超过600多种E3连接酶，E3连接酶及其配体的拓展开发仍有很大的空间。E3连接酶在细胞和组织中的表达分布具有差异性，研究表明，E3连接酶的表达相对普遍，但是也有表达窗口相对狭窄的E3连接酶：如SOCSboxE3连接酶仅在胰腺和睾丸中表达。[14]

2.                      Linker的选择

linker长度及与配体的连接位点都会影响到PROTACs的选择性和降解能力，此外，linker有可能影响PROTAC的细胞渗透率、组织分布、代谢/消除，因此对linker的优化使其与配体产生最大化的协同作用至关重要，但目前缺乏指导设计的理论依据。基于共晶设计linker的长度及连接位置，有可能为linker的设计提供方向与依据。

3.                      Hook效应

三元复合物的形成是PROTAC降解靶蛋白的关键，但PROTAC分子浓度较高时会产生Hook效应，即：PROTAC可以与E3连接酶配体和靶蛋白配体分别作用形成二元复合物，导致降解活性的下降。因此，对PROTAC的药物浓度要进行调控。[8]

Fig. 17. PROTAC-mediated ternary complex formation and Hook effect as a function of PROTAC concentration. PROTAC compound; POI ligand (royal blue), E3 ligand (dark blue) connected by a linker (black), POI (light blue), E3 (green).

4.                      PROTAC的成药性问题

对三联体的PROTAC而言，无论从分子量上还是复杂性上都违背了Christopher A. Lipinski提出的类药五原则（rule of five）。作为新技术，PROTACs未来还有很多路要走。由于PROTAC分子更像是催化剂，结合-触发（催化）-脱离，因此短暂暴露即会对蛋白通路产生持续影响，意味着药效与药代动力学不同步。PROTACs诱导底物蛋白被标记，并意味着底物蛋白一定会被蛋白酶体降解，因为同时存在泛素化的逆反应去泛素化。除了技术升级，为了走向临床，其水溶性、口服生物利用度、代谢稳定性、透膜性、合成难度和成本、PK/PD等等，依然是需要逐一克服的难题。

5.                      安全性考量

脱靶（off-target）是PROTAC安全性最大的担忧，PROTAC的作用机制是利用泛素-蛋白酶体途径清除蛋白，理论上催化剂量即可，如果非靶蛋白被降解，后果不堪设想。目前已有实验证明，基于CRBN的PROTAC分子可以诱导锌指家族蛋白的降解。此外泛素化标记不仅仅是在蛋白质降解过程中发挥作用，还参与甲基化、乙酰化、磷酸化等翻译后修饰过程，将靶蛋白清除掉会不会产生新的安全隐患，仍需进一步探究。

附：

Fig. 18. PROTACs与SMIs的优缺点[15]

Fig. 19. PROTACs已靶的关键肿瘤靶点[15]

CML Chronic myelogenous leukemia, CRPC Castration-resistant prostate cancer, NSCLC Non-small-cell lung cancer, ALCL Anaplastic large cell lymphoma, AML Acute myeloid leukemia, T-ALL T-cell acute lymphoblastic leukemia, SCLC Small-cell lung cancer, B-ALL B-cell acute lymphoblastic leukemia.

Fig. 20. 在正常组织和肿瘤中选择性表达的E3泛素连接酶

五、                      其他形式的蛋白降解策略

PROTAC是一种具有双功能的杂合小分子，通过合适的连接链将靶蛋白配体与E3泛素连接酶配体连接，促使目的蛋白（POI）与E3连接酶形成三元复合物，从而使靶蛋白接近泛素化系统，实现靶蛋白的泛素化，随后被蛋白酶体的26S亚基识别，最终导致靶蛋白降解（Fig. 21A）（只能针对胞内蛋白）。

HomoPROTAC介导E3连接酶自降解(self-degradation)。一个homo-PROTAC招募一种E3连接酶分子(如CRBN or VHL)到另一个E3连接酶分子上，之后发生E3连接酶分子双向多聚泛素化，然后两个E3连接酶分子都被蛋白酶体降解（Fig. 21B）。

PhotoPROTAC介导POI降解。在photo-PROTAC中，一个光可移动(photoremovable)基团附着在POI配体或E3连接酶配体或连接器(linker)上。在有外部光照射后，光可移动基团从photo-PROTAC上分离，将其转化为活性PROTAC，用于POI降解（Fig. 21C）。被称为第三代可控 PROTAC。photo-PROTAC 比起传统的 PROTAC 来说，在降解蛋白时更加精准可控。

苏黎世大学 Patrick Pfaff 团队，哈佛大学魏文毅教授、Nathanael Gray 教授，西奈山伊坎医学院 Jian Jin 教授，纽约大学 Michele Pagano 教授和 Dirk Trauner 教授等人都在从事光控靶向蛋白降解的研究，目前均已有研究成果公开发布。

Fig. 21.  Mechanisms of PROTAC-mediated protein degradation.[15]

分子胶（Molecular glue）也是通过结合泛素化连接酶对靶蛋白进行降解，但与 PROTAC 不同的是，分子胶是通过修饰泛素化连接酶，从而识别并降解全新底物 (Neo-substrate)。例如磺胺类抗肿瘤药 (Indisulam); 和免疫调节药物 (IMiDs) 沙利度胺 (Thalidomide)、来那度胺 (Lenalidomide)。（Fig. 22） 

Fig. 22. A.  “分子胶” 作用原理 B. 来那度胺  (Lenalidomide) 的作用机制

Sunitinib是受体酪氨酸激酶c-KIT的抑制剂，基于Sunitinib设计的降解剂在GIST-T1细胞（人胃肠道间质瘤细胞）中对c-KIT表达几乎无影响，在细胞生存率实验中也没有展现出Sunitinib类似的效果。但是PROTAC 22 (MI-389)在c-KIT依赖型的急性髓性白血病（AML）细胞系Kasumi-1中展现出显著的抗增殖活性(EC50 = 21.3 nM vs sunitinib EC50 = 17.3 nM)，更重要的是，PROTAC MI-389并没有引起c-KIT降解，表明MI-389存在c-KIT以外的降解底物。经进一步研究发现翻译终止因子GSPT1才是PROTAC MI-389脱靶后的真实降解底物。这种现象是免疫调节药物 (IMiDs) 对泛素化连接酶修饰导致的。[16]

Fig. 23. PROTAC MI-389在细胞水平的部分结果

LYTAC（Lysosome targeting chimeras）是一种溶酶体靶向嵌合体，由溶酶体靶向受体CI-M6PR的配体肽聚糖与抗体偶联得到的双功能分子。肽聚糖负责识别CI-M6PR，另一端的抗体负责结合目标蛋白。“目标蛋白-LYTAC-CI-M6PR”复合体能将目标蛋白转运进溶酶体降解，而受体自身则被循环利用并穿梭回细胞膜。该技术可以降解分泌蛋白和膜蛋白。目前一些热门靶点，如EGFR、PD-L1、ApoE4，均能通过这种技术进行降解。2019 年 3 月，斯坦福大学教授 Carolyn Bertozzi 及其团队首次报道该技术。[17]

Fig. 24. Lysosome targeting chimeras (LYTACs)

ENDTAC（ENDosome TArgeting Chimeras）也是一种双特异性小分子，一端是能识别细胞表面介导内吞作用的受体（如GPCR等）的小分子，另一端用于招募胞外目标蛋白。通过将需要降解的细胞外蛋白与细胞表面的受体连接起来，ENDTAC可以触发内吞过程，将目标蛋白吞入细胞中通过溶酶体降解。新技术ENDTAC是由PROTAC的发明人、耶鲁大学的Crews小组发明，近日发表在ACS Central Science杂志上。[18] 

Crews的工作只用了一个模型系统，是对ENDTAC技术的概念验证。膜受体选择的是CXCR7，靶蛋白选择的是融合蛋白HA-eGFP-HaloTag7 (eGFP-HT7)，Halotag是个水解酶，可以与卤代烷形成共价复合物，而eGFP是个荧光蛋白。这两个蛋白是化学生物学中常用的工具，与疾病并无关系。Fig. 25 左侧linker上的Cl负责和目标蛋白上的HaloTag7共价结合，右侧分子是膜受体CXCR7的激动剂，能诱导内吞。ENDTAC为靶向降解提供了一个新思路。

Fig. 25. ENDTAC结构

Fig. 26. ENDTAC 技术流程图

AUTAC（autophagy-targeting chimeras）是自噬靶向嵌合物，由环化鸟核苷酸（cGMP）与目标蛋白的配体连接而成，鸟苷酸化修饰是招募自噬体的一种信号，AUTAC分子可以让目标蛋白带上自噬标记，进而被运送到自噬体发生降解。[19]

Fig. 27. 利用AUTAC技术靶向降解EGFP

ATTEC（Autophagosome Tethering Compounds）。在自噬过程中，关键蛋白LC3被脂化后聚合扩增，形成膜结构，并将蛋白、脂类、细胞器等降解目标包裹于其中，形成完整的自噬小体（autophagosome），与溶酶体融合后，其中包裹的物质得以降解。然而，自噬的降解功能强大，若自噬功能整体增强而缺乏特异性，会降解所有包裹进自噬小体的蛋白。经过设计和筛选的ATTEC能特异性结合自噬关键蛋白LC3及致病蛋白而不结合正常蛋白。2019年复旦大学鲁伯埙、丁澦、费义艳团队合作研发亨廷顿病潜在新药，利用特定的绑定化合物ATTEC或称之为“小分子胶水”， 牢牢地将LC3及致病蛋白（或其他致病物质）黏在一起，进而将致病蛋白包裹进入自噬小体进行降解。同时，“小分子胶水”并不黏附野生型亨廷顿蛋白，使其得以安然无恙。经过筛选、纯化及系列细胞实验后，团队共获四个符合要求的理想化合物。[20]

Fig. 28  mHTT–LC3 linker compounds诱导 mHTT 降解的流程图

Fig. 29. 几类新型蛋白降解技术流程图[21]

(A) LYTACs utilize a glycan tag to mark an extracellular protein of interest (POI) for intracellular lysosomal degradation following receptor-mediated internalization.Note that the LYTAC paper has not yet been peer reviewed and formally published. (B) AUTACs bind to the POI and add a degradation tag mimicking S-guanylation, a post-translational modification that triggers K63 polyubiquitination (Ub) of the POI. The POI is then recognized by the autophagy receptor SQSTM1/p62 and is recruited to the selective autophagy pathway for degradation. For the AUTAC molecule, the G pentagon represents the chemical moiety mimicking S-guanylation and the linked pacman shape represents the targeting recognition moiety. (C) ATTECs interact with both the POI and LC3, tethering the POI to the phagophores or autophagosomes for subsequent autophagic degradation.

Fig. 30. PROTAC及几类新型蛋白降解技术的优缺点[21]

[1]        Sakamoto KM, Kim KB, Kumagai A, Mercurio F, Crews CM, Deshaies RJ. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001,98(15):8554-8559.

[2]        Toure M, Crews CM. Small-Molecule PROTACS: New Approaches to Protein Degradation[J]. Angew Chem Int Ed Engl, 2016,55(6):1966-1973.

[3]        Schneekloth AR, Pucheault M, Tae HS, Crews CM. Targeted intracellular protein degradation induced by a small molecule: En route to chemical proteomics[J]. Bioorg Med Chem Lett, 2008,18(22):5904-5908.

[4]        Van Molle I, Thomann A, Buckley DL, et al. Dissecting fragment-based lead discovery at the von Hippel-Lindau protein:hypoxia inducible factor 1alpha protein-protein interface[J]. Chem Biol, 2012,19(10):1300-1312.

[5]        Buckley DL, Van Molle I, Gareiss PC, et al. Targeting the von Hippel-Lindau E3 ubiquitin ligase using small molecules to disrupt the VHL/HIF-1alpha interaction[J]. J Am Chem Soc, 2012,134(10):4465-4468.

[6]        Bondeson DP, Mares A, Smith IE, et al. Catalytic in vivo protein knockdown by small-molecule PROTACs[J]. Nat Chem Biol, 2015,11(8):611-617.

[7]        Winter GE, Buckley DL, Paulk J, et al. DRUG DEVELOPMENT. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation[J]. Science, 2015,348(6241):1376-1381.

[8]        Pettersson M, Crews CM. PROteolysis TArgeting Chimeras (PROTACs) - Past, present and future[J]. Drug Discov Today Technol, 2019,31:15-27.

[9]        Reynders M, Matsuura BS, Berouti M, et al. PHOTACs enable optical control of protein degradation[J]. Sci Adv, 2020,6(8):eaay5064.

[10]        Liu J, Chen H, Ma L, et al. Light-induced control of protein destruction by opto-PROTAC[J]. Sci Adv, 2020,6(8):eaay5154.

[11]        Sun Y, Ding N, Song Y, et al. Degradation of Bruton's tyrosine kinase mutants by PROTACs for potential treatment of ibrutinib-resistant non-Hodgkin lymphomas[J]. Leukemia, 2019,33(8):2105-2110.

[12]        Bai L, Zhou H, Xu R, et al. A Potent and Selective Small-Molecule Degrader of STAT3 Achieves Complete Tumor Regression In Vivo[J]. Cancer Cell, 2019,36(5):498-511 e417.

[13]        Guo J, Liu J, Wei W. Degrading proteins in animals: "PROTAC"tion goes in vivo[J]. Cell Res, 2019,29(3):179-180.

[14]        Burslem GM, Crews CM. Proteolysis-Targeting Chimeras as Therapeutics and Tools for Biological Discovery[J]. Cell, 2020,181(1):102-114.

[15]        Khan S, He Y, Zhang X, et al. PROteolysis TArgeting Chimeras (PROTACs) as emerging anticancer therapeutics[J]. Oncogene, 2020,39(26):4909-4924.

[16]        Ishoey M, Chorn S, Singh N, et al. Translation Termination Factor GSPT1 Is a Phenotypically Relevant Off-Target of Heterobifunctional Phthalimide Degraders[J]. ACS Chem Biol, 2018,13(3):553-560.

[17]        Steven M. Banik KP, Simon Wisnovsky, Nicholas M. Riley, Carolyn R. Bertozzi. Lysosome Targeting Chimeras for the Degradation of Secreted and Membrane Proteins[J]. chemrxiv, 2019.

[18]        Nalawansha DA, Paiva S-L, Rafizadeh DN, Pettersson M, Qin L, Crews CM. Retraction of “Targeted Protein Internalization and Degradation by ENDosome TArgeting Chimeras (ENDTACs)”[J]. ACS Central Science, 2020,6(2):312-312.

[19]        Takahashi D, Moriyama J, Nakamura T, et al. AUTACs: Cargo-Specific Degraders Using Selective Autophagy[J]. Mol Cell, 2019,76(5):797-810 e710.

[20]        Li Z, Wang C, Wang Z, et al. Allele-selective lowering of mutant HTT protein by HTT-LC3 linker compounds[J]. Nature, 2019,575(7781):203-209.

[21]        Ding Y, Fei Y, Lu B. Emerging New Concepts of Degrader Technologies[J]. Trends Pharmacol Sci, 2020,41(7):464-474.